2型糖尿病晚期糖基化终末产物与糖尿病视网膜病变的关系

皮肤 AGE 在糖尿病视网膜病变中的应用研究

Lingwen Ying a,1, Yun Shen a,1, Yang Zhang b,c,1, Yikun Wang b,*, Yong Liu b, Jun Yin a,Yufei Wang a, Jingrong Yin a, Wei Zhu a, Yuqian Bao a, Jian Zhou a,* a Department of Endocrinology and Metabolism, Shanghai Jiao Tong University Affifiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Clinical Centerfor Diabetes; Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai 200233, Chinab Anhui Institute of Optics and Fine Mechanics, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, Chinac University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China

糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy，以下简称“DR”）是由视网膜毛 细血管的长期损伤引起的，也是糖尿病的主要微血管并发症之一。由于世界范围 内糖尿病患病率的上升，糖尿病合并 DR 的患病率也持续上升，在中国糖尿病人 群中估计达 18.5%。越来越多的证据表明，DR 是全球成年人视力丧失和失明的 主要原因，血糖控制不佳是 DR 发生的重要因素。因此，应该强调高血糖的不良 后果和血糖管理的重要性，充分重视血糖控制。 糖化血红蛋白（HbA1c）是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类（主要指葡 萄糖）通过非酶反应相结合的产物，通常认为，HbA1c浓度可有效地反映过去 8~12 周血糖平均水平。HbA1c是评估血糖控制的公认金标准，世界范围内的大规模人 群研究表明，HbA1c的改善显著降低了糖尿病患者（1 型和 2 型）大血管和微血 管并发症的风险。因此，目前血糖控制管理主要通过 HbA1c进行评估，检测水平 越低，表明血糖控制的越好。然而，HbA1c在使用时也受到一些限制，有几个因 素会干扰 HbA1c 的测量，例如遗传变异（如 HbS 性状、HbC 性状）、胎儿血红 蛋白升高和化学修饰的血红蛋白衍生物，这些因素会影响 HbA1c测量的准确性。 此外，其他原因导致缩短或降低红细胞存活率和平均寿命的任意因素也会影响对 HbA1c结果的解释。尽管 HbA1c是公认的 DR 风险因素，但 DCCT 的研究结果显 示，常规胰岛素治疗组的 DR 风险显著高于强化胰岛素治疗组，而两组的 HbA1c 水平相当。最近的一项荟萃分析探讨了糖尿病视网膜病变的潜在危险因素，发现 除了糖化血红蛋白浓度较高外，胰岛素治疗和空腹血糖水平升高等因素都与糖尿 病患者的糖尿病视网膜患病率较高有关联性。这些发现提示了存在着除糖化血红 蛋白以外的其他与血糖控制相关的因素可能与 DR 发病有关的可能性。作为长期 血糖控制的标志物，HbA1c并不反映血糖控制的个体模式，也就是说，HbA1c相 似的患者可能有完全不同的血糖谱。 因此，人们一直致力于寻找糖化血红蛋白以外的替代指标。研究表明，AGE 除了参与糖尿病的发生发展外，与糖尿病视网膜病变也密切相关。一般认为， AGE 导致糖尿病视网膜病变主要通过两种方式：①AGE 的蓄积可以导致视网膜 微血管内皮细胞的损伤和炎症反应的发生；②AGE 的增加可以上调视网膜毛细 血管周细胞 RAGE（AGE 受体）的表达，促进 RAGE 与 AGE 结合，激活下游信 号通路，导致血管新生因子水平如 VEGF、细胞因子、生长因子等显著升高，对 视网膜周细胞造成损伤。 此外，当前的糖尿病诊断切点主要依据是达到一定血糖水平时糖尿病视网膜病变的发生率急剧升高而制定的。因此，研究 AGE 与糖尿病视网膜病变的关联 性对于寻找 AGE 切点以及 DR 的早期检测有重要的应用价值。

研究对象与方法

1. 研究对象 本研究的入选标准为：①诊断为 2 型糖尿病，年龄≥18 岁；②前 3 个月有 稳定的降糖方案；③完成皮肤 AGE 测量系统检测的 AGE 数据；④获得参与者的 书面知情同意。本研究获得了上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会的批 准，并符合《赫尔辛基宣言》的原则。排除标准为：①被测位置周围有传染性皮 肤疾病；被测位置皮肤有明显水肿症状；②研究者判断患者依从性差、无法按照 要求完成研究或不同意签署知情同意书。本研究在上海市第六人民医院内分泌代 谢科住院部共计采集了 1471 例的成年 2 型糖尿病患者，所有受试者均通过皮肤 组织糖基化终产物荧光测量系统测定 AGE，并通过眼底摄片评估是否存在 DR。 DR 的诊断及分级参考国际糖尿病视网膜病变分类标准，分为非 DR、轻中度非 增殖性 DR（NPDR）、重度 NPDR 和增殖性 DR（PDR）。其中，由于 1471 例 受试者中仅 4 例为 PDR，本研究把重度 NPDR 和 PDR 合并定义为威胁视力的 DR（VTDR）。

2. AGE 检测和其他信息收集

采用皮肤 AGE 测量系统在左前臂内侧的正常皮肤部位，即没有可见血管、 疤痕、苔藓化或其他皮肤异常的部位，测量三次皮肤 AGE，取平均值。在预实 验中由于 569 名参与者的左臂和右臂的 AGE 水平没有统计学差异（72.9±9.7 vs.71.9±10.1，P>0.05），因此本研究采用左侧皮肤 AGE 结果进行统计分析。 通过自我报告收集吸烟情况（当前是否吸烟）、病史、糖尿病家族史、降压 药、降糖药、降脂药等药物处方使用等信息。每个病人都接受了包括身高、体重 和血压在内的体格检查。体重指数（BMI）计算为体重（kg）/高度 2（cm2）。 用水银血压计，每隔 5 分钟测量三次血压，并计算平均值进行分析。此外，测定 了包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、 低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、肌酐（Cr）、空腹 C-肽（FCP）、糖化血红蛋 白（HbA1c）、糖化白蛋白（GA）和空腹 C 肽等生化指标。根据 CKD-EPI 方程 计算估计肾小球滤过率（eGFR）。

3. 统计学分析方法

一般资料（连续变量和分类变量）与糖尿病视网膜病变的严重程度之间的差 异采用 Jonckheere-Terpstra 检验和 Linear-by-linear Association 趋势检验。使用 Logistic 回归评估 AGE 四分位数与 DR 之间的关联性。所有分析均根据年龄（模 型 1）进行调整，然后根据性别、糖尿病病程、BMI、SBP、DBP、血脂水平、 HbA1c、GA、eGFR、糖尿病家族史、吸烟状况、抗糖尿病治疗、抗高血压药物、 降脂药物和阿司匹林的使用（模型 2）再进行调整。采用限制性三次样条的 Logistic 模型检验 AGE 作为一个连续变量是否与 DR 的发生率存在剂量反应或非线性关 联。用受试者工作特征（ROC）曲线评价相关指标在 DR 早期发现中的有效性， 并考虑 P<0.05 为有统计学意义。ROC 曲线是以真阳性率（Sensitivity，灵敏度， 即预测为正且实际为正的样本占所有正例样本的比例）为纵坐标，假阳性率（1- 特异度，1-Specificity，预测为正但实际为负的样本占所有负例样本的比例）为横坐标绘制的曲线，通过计算 ROC 曲线下的面积进行两种方法的比较，曲线下 面积越大，诊断价值越高。

比值比（OR）的定义：表示疾病与暴露因素之间关联强度的指标，指暴露 者的疾病危险性为非暴露者的多少倍。

研究人群的一般资料

共有 1471 名糖尿病患者被纳入最终分析，其中 59.8%为男性，40.2%为女性。 平均年龄为 60±12 岁，平均糖尿病病程为 13±8 岁。在 1471 名受试者中，372 名 为 DR，总患病率为 25.3%。根据 DR 的严重程度进一步分类显示，轻中度 NPDR 和 VTDR 的患病率分别为 22.6%（332/1471）和 2.7%（40/1471）。表 4.4 列出 了随着 DR 不同严重程度组别的临床特征。其中糖尿病病程、收缩压、HbA1c、 GA、有糖尿病家族史的患者百分比和胰岛素患者百分比随着 DR 严重程度的增 加而增加，空腹 C 肽（FCP）和口服降糖药的患者比例均下降（均 P<0.05）。皮 肤 AGE 也随着 DR 的严重程度而增加（P<0.001）。

皮肤 AGE 与 DR 的关联性分析

根据 AGE 的四分位数进行分层（第一分位 1：<71.5；第二分位 2：71.5–77.6； 第三分位 3：77.6–84.4；第四分位 4：≥ 84.4)。校正年龄、性别、BMI、糖尿病 持续时间、收缩压、舒张压、血脂水平、糖化血红蛋白、GA、糖尿病家族史、 吸烟状况、降糖药物的使用、抗高血压药物的使用、降脂药物的使用和阿斯匹林 的使用等因素后，AGE 四分位组与存在 DR 的比值比（OR 值）分别为 1.00、1.69 （95%CI 1.16–2.47）、1.58（95%CI 1.06–2.37）和 1.60（95%CI 1.05–2.44） （P=0.044）。同样地，校正多变量后，AGE 四分位组与存在 VTDR 的优势比（OR 值）分别为 1.00、1.75（95%CI 0.31–9.97）、5.14（95%CI 1.03–25.65）和 8.70 （95%CI 1.78–42.59）（P=0.009）。而轻中度 NPDR 的优势比（OR 值）分别为 1.00、1.67（95%CI 1.14–2.45）和 1.40（95%CI 0.93–2.11）和 1.22（95%CI 0.79–1.88） （P=0.050），结果见表 4.5。

采用限制性三次样条把皮肤 AGE 作为一个连续变量处理时，可以观察到 AGE 的值与 DR 的发生率呈显著正相关（趋势 P<0.001）（图 4.6）。该曲线趋 势与表 4.5 中把 AGE 作为分类变量的结果一致。

Osawa 等人曾进行了一项研究，包括 193 名糖尿病患者和 24 名健康对照人 群，结果表明 AGE 是 DR 的独立危险因素。另一项包含 135 名 1 型青少年糖尿病的研究结果提示青少年 DR 患者的 AGE 明显较高，而多因素分析也表明 DR 与 AGE 显著相关。与以往的研究一致，在本研究中 AGE 水平与 DR 的发生率呈 正相关，AGE 与各个阶段的 DR 患病率也有很大的相关性，甚至调整了临床其 它风险因素，包括 HbA1c，这表明 AGE 在评估糖尿病并发症风险方面的应用价 值与 HbA1c无关。最重要的是皮肤 AGE 荧光光谱法是一种非侵入性的检测方法。 Hu H 等人的研究采用 LC-MS 对 33 例糖尿病和非糖尿病患者的动脉、神经和皮 肤中的 AGE 水平进行了评估，结果表明，皮肤中的 AGE 含量与其他组织中的 AGE 含量密切相关，为无创性皮肤 AGE 检测反映整个机体的 AGE 蓄积水平提 供了理论依据。提示 AGE 可能是一个独立于 HbA1c预测 DR 的有效指标。

皮肤 AGE 切点探讨

用 ROC 曲线评估 AGE 和 HbA1c 用于 DR 早期筛查的诊断价值。ROC 曲线 下面积（AUC）结果见表 4.6。结果显示，AGE 和 HbA1c在总 DR 中的 AUC 相 当，具体来说，AGE 为 0.560（95%CI 0.534-0.586），HbA1c 为 0.565（95%CI 0.539-0.590）（P=0.844）。尽管这两项指标对总 DR 的预测价值相当，但研究表明 AGE 与 HbA1c在敏感性和特异性上存在差异（均 P<0.001）。AGE 早期发现 DR 的最佳临界点为 72.3，敏感性为 79.6%（95%CI 75.1–83.6%），特异性为 31.3% （95%CI 28.6–34.1%）。HbA1c 的最佳临界点为 8.4%，敏感性和特异性分别为 59.1%（95% CI 54.0-64.2%）和 53.1%（95% CI 50.0-56.0%）。以 AGE 和 HbA1c 作为早期发现轻中度 NPDR 的指标也有相当的应用价值（P=0.205）。就 VTDR 而言，AGE 在早期筛查中的应用价值显著高于 HbA1c（P=0.002）。以 77.1 为分 界点，AGE 的敏感性、特异性和 AUC 分别为 90.0%（95%CI 76.3–97.2%）、49.4% （95%CI 46.8–52.0%）和 0.728（95%CI 0.704–0.750）。HbA1c＞8.4%时，VTDR 的敏感性、特异性和 AUC 分别为 70%（95% CI 53.5～83.4%）、50.5%（95% CI 47.9～53.1%）和 0.562（95% CI 0.536 - 0.536）。

因此，本研究结果提示 AGE 可能是一个比 HbA1c更合适的指标，用于早期 筛查 DR 和 VTDR，评估中国糖尿病人群高血糖的不良预后。结果显示，虽然这 两个指标的 ROC 曲线下面积在总的 DR 早期预测中没有显著差异，但当 AGE>72.3 时，检测总 DR 的敏感性明显高于 HbA1c。由于在确保一定筛查效率 的情况下，预测阳性人群的能力（即敏感性）比特异性更重要，因此 AGE 可能 是总 DR 预测的更好的预测指标。此外，当 AGE 的切点值为 77.1，相比 HbA1c>8.4%，检测 VTDR 更为合理，因为 AGE 的 AUC 和敏感性与 HbA1c相比 明显增加，但具有相似的特异性。

小结

本研究征集了 1471 名糖尿病患者人群，开展了 AGE 指标与糖尿病视网膜病 变（DR）的关联性研究。非侵入法测定的皮肤 AGE 水平与不同程度 DR 的患病 率显著正相关，并且这种相关性独立于 HbA1c。对于 VTDR 患者，AGE 的早期 筛查价值显著优于 HbA1c（P = 0.002），此时 AGE 的最佳切点为 77.1，其敏感 性、特异性和 ROC 曲线下面积（AUC）分别为 90.0%（95%CI 76.3-97.2%）、 49.4%（95%CI 46.8-52.0%）和 0.728（0.704-0.750）。本研究提供的证据表明， 对于 DR，尤其是 VTDR 的早期检测，AGE 可能比 HbA1c更有应用价值，是反映 高血糖不良预后的有效指标。